雙脫氧鏈終止法的原理,雙脫氧鏈終止法的Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式

2021-08-09 21:19:37 字數 1828 閱讀 3654

1樓:鬱悶的太陽

雙脫氧鏈終止法是現在應用最多的核酸測序技術(也即第一代dna測序技術),由sanger等2023年發明提出。主要用於dna基因分析。其原理是:

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下複製或轉錄時,如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基,只要雙脫氧鹼基摻入鏈端,該鏈就停止延長,鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。

如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端,以雙脫氧鹼基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後,分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個鹼基),根據片段3’端的雙脫氧鹼基,便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。

sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式 操作程式是按dna複製和rna反轉錄的原理設計的。

1.分離待測核酸模板,模板可以是dna,也可以是rna,可以是雙鏈,也可以是單鏈。

2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dntp(包括放射性標記的ddntp,例如32p ddntp和dna聚合酶(如以rna為模板,則用反轉錄酶),再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddntp(雙脫氧核苷酸)。

3.與單鏈模板(如以雙鏈作模板,要作變性處理)結合的引物,在dna聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應,32p隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddntp摻入時,由於它在3’位置沒有羥基,故不與下一個dntp結合,從而使鏈延伸終止。

ddntp在不同位置摻入,因而產生一系列不同長度的新的dna鏈。

4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物,由於每一反應管中只加一種ddntp(如ddatp),則該管中各種長度的dna都終止於該種鹼基(如a)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的dna 3’ 末端都為同一種雙脫氧鹼基。

5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中dna帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。

2樓:手機使用者

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下複製或轉錄時,如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基,只要雙脫氧鹼基摻入鏈端,該鏈就停止延長,鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端,以雙脫氧鹼基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後,分四個泳道進行電泳。

以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個鹼基),根據片段3’端的雙脫氧鹼基,便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。

雙脫氧鏈終止法的sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式

3樓:匿名使用者

(一) sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程式 操作程式是按dna複製和rna反轉錄的原理設計的。

1.分離待測核酸模板,模板可以是dna,也可以是rna,可以是雙鏈,也可以是單鏈。

2.在4只試管中加入適當的引物、模板、4種dntp(包括放射性標記的ddntp,例如32p ddntp和dna聚合酶(如以rna為模板,則用反轉錄酶),再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddntp(雙脫氧核苷酸)。

3.與單鏈模板(如以雙鏈作模板,要作變性處理)結合的引物,在dna聚合酶作用下從5’端向3’端進行延伸反應,32p隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddntp摻入時,由於它在3’位置沒有羥基,故不與下一個dntp結合,從而使鏈延伸終止。

ddntp在不同位置摻入,因而產生一系列不同長度的新的dna鏈。

4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4只反應管中的反應產物,由於每一反應管中只加一種ddntp(如ddatp),則該管中各種長度的dna都終止於該種鹼基(如a)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的dna 3’ 末端都為同一種雙脫氧鹼基。

5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中dna帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。

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