1樓：匿名使用者
正常，wb檢測限本來就靈敏，免疫螢光做不出來原因很多。首先你要確定你蛋白表達的水平，皮克級還是納克級？再確定免疫螢光的檢測限，然後再一步一步分析原因。
高保真生物技術****~~~實驗整體外包服務商~
細胞免疫螢光，求助
2樓：南京金益柏生物科技****
細胞爬片免疫螢光實驗步驟
第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， pbs浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%triton x-100( pbs配製 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
4. pbs浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸乾pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗並放入溼盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加螢光二抗： pbst 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸乾爬片上多餘液體後滴加稀釋好的螢光二抗，溼盒中20-37℃孵育1h，pbst浸洗切片3次，每次3min；
注意：從加螢光二抗起，後面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加dapi避光孵育5min，對標本進行染核，pbst 5min×4次洗去多餘的dapi；
8. 用吸水紙吸乾爬片上的液體，用含抗螢光淬滅劑的封片液封片，然後在螢光顯微鏡下觀察採集影象。
如何做好免疫螢光
3樓：南京金益柏生物科技****
免疫螢光是標記免疫技術發展最早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫螢光步驟包括，細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。
1、細胞固定和通透
為達到最佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要保證最佳的結構，並利於抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：
細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之後用0.1%皂角苷或0.02%的triton x-100進行通透。
前者是比較溫柔的處理，但是對於核內抗原可能無效，需要用到triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。
2、抗體特異性
免疫螢光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的**作為陰性對照，有利於減少降低背景干擾。
3、合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。
但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高訊號強度。如果是第一次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。
4、優化緩衝液和封閉劑
儘管很多抗原在常見的buffer如pbs中可以很好的被染色，但是對於某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩衝液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。rockland可提供優化過的ihc用封閉緩衝液，同樣適用於螢光染色實驗。
5、選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那麼必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。
6、使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。
7、多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬**不同，標記物不同，而二抗的種屬**需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫螢光常見的問題，解決此問題可以用二抗**的正常血清代替bsa做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鐘，推薦洗滌液為pbs+0.05%tween。
9、封片
作為免疫螢光的最後一步，可以提高折射率，保護樣品。
10、資料分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行資料獲取與分析。
關於細胞免疫螢光染色的問題
4樓：匿名使用者
(1)你的二抗是用fitc標記的，為避免螢光分解，分裝及螢光顯微鏡觀察時均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氫鹽緩衝液，後者能使玻片透明;
(3)關於免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%h2o2以去除內源性過氧化物酶;2n鹽酸需要使用，目的是使dna變性，讓brdu抗體能夠充分地與已經摻入的brdu結合。
做間接法免疫螢光染色，如何設定對照?
參考見解:最好是同一視野在未用螢光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
(1)空白對照:如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發螢光，脫蠟後直接在螢光顯微鏡下觀察。
(2)陰性對照:標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
(3)抗原對照:標本加同種動物的未免疫血清，以pbs沖洗後，在加抗免疫球蛋白螢光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
如何做蛋糕，如何做蛋糕
雞蛋上戳洞倒出蛋液，加麵粉 白湯 檸檬汁攪拌均勻放入裱花袋擠進蛋殼裡 烤箱烤30分鐘後剝殼，加點綴。打發好的麵糊醒發三十分鐘 雞蛋 250 克 約五隻小蛋 糖 110 克 麵粉 80 克 冇糖朱古力粉 2 湯匙 鹽 1 8 茶 牛油 煮溶 40 克 白蘭地酒 1荼匙 裝飾用具 忌廉 250 亳公升 ...
如何做理財，新手如何做理財
理財產品都是根據自身的經濟來決定的，想要選擇好的產品，你可以根據以下幾點擊擇 一 產品本質，一些投資理財產品是固定收益類，風險較低，產品到期基本能實現預期收益率。還是浮動收益類，風險較高，預期收益率並不能實現。另外，一些網際網路金融理財產品，本質是 還是保險產品，這些都需要投資者看清楚。二 理財產品...
如何做分錄，請教如何做分錄
借 銀行存款1300 貸 庫存現金1300 借 材料採購 甲材料180000 應交稅費 應交增值稅進項稅額30600 貸 銀行存款210600 借 材料採購 乙材料176000 應交稅費 應交增值稅進項稅額29920 貸 應付賬款205920 甲材料承擔運費 840 2000 800 2000 60...