1樓：北京索萊寶科技****
沒有什麼影響,放心做下去吧
就是不要吹打,輕輕攪一下就好了
因為感受態比較脆弱，吹打會殺死它們。由於鈣等離子附著在細胞膜上，形成液晶狀態，所以細胞膜會變得很脆弱，在轉化復甦之前，都要輕輕地操作
影響感受態細胞製備的因素有哪些
2樓：淵源
1．細菌的生長狀態：實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測od600來控制。dh5α菌株 od600為 0.
5 時細胞密度是 5 × 107/ml ）。
2．所有操作均應在無菌條件和冰上進行。
3．經 cacl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24小時達到最高，之後轉化率再下降（這是由於總的活菌數隨時間延長而減少造成的）。
4．化合物及無機離子的影響：在 ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子（如 mn2+或 co2+）、 dmso 或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（ 100-1000 倍）。
5．所使用的器皿必須乾淨。跡量的去汙劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率。
6．質粒的大小及構型的影響：用於轉化的應主要是超螺旋的 dna。
7．一定範圍內，轉化效率與外源 dna 的濃度呈正比。
感受態細胞的製備時有什麼注意事項
3樓：置嚼勒眯
方法一：細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
本法適用於大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。1．從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取乙個單菌落（如大腸桿菌dh52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到乙個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。
於37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量od600值≈0.4。2．在無菌條件下將細菌轉移到乙個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．於4℃用sorvallgs2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。4．倒數培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。5．以10ml用冰預冷的0.
1mmcacl2重懸每份沉澱，放於冰上。6．於4℃用sorvallgs3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。7．倒出培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8．每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1mcacl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna或連線反應混合物（體積≤10μl，dna≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預加溫到40℃的迴圈水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。12．每離心管加800μlsoc培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/lmgso4和相應抗生素的sob培養基上。14．將平板置於室溫至液體被吸收。15．倒置平皿，於37℃培養，12～16h後可出現菌落。
方法二：cassuperone-step***petentcellprepskit採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便於質粒dna的轉化，可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點：
使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的製備；轉化效率略高於cacl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞製成後即可儲存於-70℃,無須加入甘油，並且經長期儲存活力無明顯下降。準備工作：1．從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在lb平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。
挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5mllb培養基中，37℃，250rpm，過夜培養。2．次日從5mllb培養物吸取200μl轉入50mllb培養基中（250ml錐形瓶），37℃，250rpm培養2小時，此時od600約0.4—0.
5。感受態細胞的製備：3．吸取1ml菌液到1.
5ml離心管裡，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。4．加入100μl預冷的solutiona，懸浮菌體，冰浴30分鐘。5．此時感受態細胞已經製成可立即使用或-70℃儲存。
細胞轉化：6．在感受態細胞中加入100pg-10ngdna，混勻，冰浴30分鐘，然後42℃1分鐘熱擊，再次冰浴2分鐘。加入0.
9mllb培養基，20μlsolutionb，37℃，振盪培養1小時。7．取適當菌液（100-200μl）塗佈相應抗性的平板。8．過夜培養約16個小時，數菌落數，計算轉化率。
補充說明：1．所用器具一定要清潔；2．操作步驟2中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高於此值：500ml錐形瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；3．在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2，效果會更好一些；4．為保證細胞處於對數生長期，培養後的菌體的od值不要高於0.
6；5．製備感受態細胞時所有操作盡量保證在冰上操作；6．細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴後直接加入新鮮lb，簡化操作步驟，但轉化效率低於熱擊方法，適用於對轉化率要求不高的實驗。方法三：1、取1%大腸桿菌e.
coli接種於含2mllb培養基的試管中，37℃振盪培養過夜2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10mllb培養基的三角瓶中，37℃振盪培養3h至od600=0.3ml離心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1mcacl2溶液中，置冰上30min6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液7、將菌體懸浮於0.1mlcacl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：（1）將1ml過夜培養的細菌（如dh52、tg1、tm101）接種於100ml2×yt培養於500ml燒瓶。於37℃刷烈振盪，通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.
2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。（2）將培養物放於冰上致冷10min，於4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。
（3）棄除上清，將細菌懸浮於原始培養體積的一半（約50ml）的50mmcacl2和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍液體中。（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。
（5）棄上清，懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞，即可用於轉化。
200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中，貯存於-80℃冰箱中。方法五：
tsb法（也是本人熱衷的方法）1.藥品製備1mmg2+(1mmgso4和1mmgcl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。
tsb液（30ml/80ml菌液）（現配現用）：peg33503gtryptone0.3gyeastextract0.
15gnacl0.3g2.步驟：
（1）活化菌株（2）挑單菌落培養於5ml的液笨培養基中（3）取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養（4）370c培養3－4小時，od600在0.4－0.6（5）離心，去上清（6）加入20mltsb，重懸（7）離心，去上清（8）加入10mltsb，再加入15－20%的甘油，分裝儲存注，整個操作過程均應在冰上進行。
所用藥品均需滅菌。轉化程式（1）取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化，並立即放於冰上，加入dna或連線反應混合物，dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然後放在冰上40～45min。
（2）將管放於42℃水浴中2min。（3）然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基，倒置混勻，並於37℃培養8～12h，幹浴或水浴，不需振搖。
此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。（4）每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素，並含有x-gal（20mg/ml）、iptg（200mg/ml）。
大腸桿菌感受態細胞製備時的cacl2濃度到底是多少
4樓：匿名使用者
（1）質粒dna的質量和濃度： 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。 （2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃ （3）細胞的生長狀態和密度 最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫公升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。 （二）感受態細胞轉化中的影響： 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。
所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
製備感受態細胞時,應特別注意哪些環節
1 整個實驗過程均需置於冰上進行。2 選用對數生長期細胞，od600在0.4 0.5間。3 所有操作必須做到嚴格無菌，防止雜菌和雜dna的汙染。4 動作不應太劇烈，減少細胞的機械損傷。保證感受態細胞的活性，所有操作盡量在冰上，暴露在空氣中的時間盡量短。1 整個實驗過程均需置於冰上進行。2 選用對數生...
stbl3和DH5a感受態細胞的區別
首先，這兩種菌的基因型不一樣，這就導致了這兩種菌有不同的用途 dh5a是用於轉殖的，構建質粒，建庫，保藏質粒，等等，用的是它。bl21是專門用來表達蛋白的，如果用於儲存質粒，質粒會很不穩定。轉化實驗中除了用大腸桿菌的感受態細胞還可以用哪種菌的感受態細胞?要看你做的是什麼了。大腸桿菌感受態根據用處的不...
製作大腸桿菌感受態細胞為什麼離心用四千轉速
轉速低了離不下來，轉速高了到時候重選在轉化液裡很麻煩，所以要選取乙個合適的值。話說一半不用rpm來算，因為不同的離心機，力矩不一樣，不同轉速會有不同的離心力。所以一般用g，一般是1500 3000g都可以的。大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌 ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一...