1樓：匿名使用者
你要擴大的是質粒不是pcr片段，直接pcr哪能擴那麼大的質粒啊，而且質粒還是環形的，怎麼做pcr，所以當然是搖菌啦
2樓：蘋果是最好的
質粒是環狀dna分子是乙個有生命活力的個體，如果需要大量的擴增，就必須用生物擴增法，就像乙個生命體在不斷繁殖一樣，借助感受態細胞繁殖就會越來越多。pcr屬於一種機械擴增，是機械性的將乙個乙個個體拼接起來，就像咱們化學合成一樣，而且他擴增的只是乙個dn**段。再者，dna本來就是生命體內的東西，那肯定是，在生物體內繁育擴增，才是最有效快捷的方法。
3樓：匿名使用者
主要是效率問題， 通過菌體繁殖而進行的擴增是pcr的若干倍。
pcr可以擴增質粒嗎？為什麼有了pcr還要用大腸桿菌搖質粒？
4樓：匿名使用者
pcr一般用來擴增雙鏈的dna，所以如果是雙鏈的質粒就能用pcr擴增。不過pcr擴增有可能回會產生突變。如果用高答保真的酶擴增，突變概率比較小，但是很貴。
此外，pcr會在雙鏈dna末端加鹼基，作為質粒，pcr玩你還要去送測序。還不如用大腸桿菌擴增。
dh5α感受態細胞不表達自身的質粒嗎？擴增質粒後提取質粒的時候會不會把大腸桿菌自身的質粒也提取出來
5樓：頹小廢
對，它不表達自身質粒，因為培養基裡有抗生素，只有
攜帶抗生素基因的質粒（也就是專我們轉化到感受態裡的
屬質粒）才能表達，所以長出來的全都是含抗生素基因質粒的菌。所以提取出來的質粒肯定全都是我們轉入要轉殖的重組質粒。
6樓：艾康生物
你好！dh5α感受
bai態細胞是常用的細菌du
質粒擴增zhi提取細菌，其本身dao是含有質粒的。普通的大腸桿菌回細胞答內有一種「免疫」機制，即當外源dna 侵入時，會產生酶類將外源dna切除，無法進行複製增殖。而其自身質粒的基因組被修飾（如甲基化）所以不被限制酶識別，不會被剪下。
dh5α菌株是一種經誘變的菌株，其基本特性是：缺乏自身dna 修飾，缺乏「免疫」機制，不會對匯入的外源dna切割，並對氨苄青黴素敏感。因此dh5α用於質粒擴增時候，其自身的質粒不會被擴增，而外援質粒同樣不會被切割，因此可以用於基因工程。
生物實驗室為什麼要單獨買感受態細胞用
7樓：臺鴻飛
自己做不划算
（試劑+耗材+人力+成功率）
算算賬，還是買來比較划算。
質粒轉化為什麼只有乙個質粒進入感受態細胞,同時進入幾個質粒有可能嗎?為什麼?謝謝!
8樓：阿魯巴星人
兩種質粒是可抄
以同時進入同乙個感受態細胞的，比如構建腺病毒載體時。但是要求兩種質粒進入同乙個感受態細胞，轉化效率非常低，一般需要電轉或者其他的特殊處理。
由於質粒的不相容性，擁有同種複製子的質粒不能在同一細胞內穩定共存，經過幾代的複製，會質粒丟失，所以並不是任何兩個或兩個以上質粒都可以在同一細胞內穩定存在，但是可以同時進入。
9樓：風與流年
你要知道質粒是dna呀，他在感受態細胞是可以複製的！ 同時同時放入多個是浪費呀！
質粒擴出來了，產物是環狀的嗎
10樓：
質粒是細菌染色體外的雙鏈環狀的能自我複製的小分子dna。
質粒對細菌本內身的生長容繁殖不是必需的，但可以賦予細菌一定的表型，如抗藥性等。
它是基因操作工程中常用工具中載體的一種。是攜帶目的dn**段進入受體細胞進行擴增和表達的工具。
質粒的性質中與載體作用關係密切的包括：
1、質粒的複製型
2、質粒的不相容性
3、質粒的接合性
4、多轉殖位點
5、篩選標記
在感受態細胞培養過程中 搖菌時的溫度對其效價影響大嗎
如何擴增及提取表達載體？是不是匯入感受態細胞培養，然後直接提取質粒就可以？怎麼確是我的表達載體質粒
11樓：匿名使用者
不對，copy
通過轉化到感受態細菌中bai，不是細胞du。感受態的大腸桿菌zhi，可以自己
製作也可以通過購dao買。之後將細菌凃到含有抗生素的板子上，長出轉殖後挑取單轉殖，將單轉殖加入含有抗生素的細菌培養基中培養，之後提取質粒，提取質粒可以購買相應的試劑盒，按照試劑盒的說明書操作即可。質粒是帶有抗性基因的，只有含有該質粒的細菌才能在含有對應抗生素的培養基中存活並增殖，這樣就能確保是你的表達載體質粒。
當然為了防止雜菌的汙染，整個過程中最好是無菌操作。而表達載體質粒有可能出現突變等情況，所以可以在提出質粒之後，取少量質粒送測序，來確保序列的無誤。
pcr需要注意的問題
12樓：春素小皙化妝品
1、pcr產物的電泳檢測時間：一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。
2、假陰性，不出現擴增條帶
模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體中的組蛋白，在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。
模板核酸變性不徹底。在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易瀰散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增。
對策為：選定乙個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
3、假陽性
出現的pcr擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行pcr擴增時，擴增出的pcr產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，與引物互補後，可擴增出pcr產物，而導致假陽性的產生，可用巢式pcr方法來減輕或消除。
4、出現非特異性擴增帶
pcr擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr迴圈次數過多有關。
其次是酶的質和量，往往一些**的酶易出現非特異條帶而另一**的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。
減低酶量或調換另一**的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少迴圈次數。
5、出現片狀拖帶或塗抹帶
pcr擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dntp濃度過高，mg2+濃度過高，退火溫度過低，迴圈次數過多引起。其對策有：
減少酶量，或調換另一**的酶。減少dntp的濃度。適當降低mg2+濃 度。
增加模板量，減少迴圈次數。
13樓：河傳楊穎
實驗操作注意事項：儘管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
2、使用一次性吸頭，嚴禁與pcr產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染。
3、避免反應液飛濺，開啟反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dntp、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度。
cr由變性→退火→延伸三個基本反應構成：
1、模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。
2、模板dna與引物的退火（復性）：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合。
3、引物的延伸：dna模板--引物結合物在72℃、dna聚合酶（如taqdna聚合酶）的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈。
14樓：量子天堂
pcr需要注意以下事項：
1.模板
盡量避免含有酶抑制劑！
2.引物
儲存時間不易過長，要符合引物涉及的原則，在用軟體設計結束後要進行適當的人工處理。引物濃度要合適，太高容易引起錯配及非特異性產物的形成。
3.迴圈引數
一般退火溫度應低於tm值5℃。先迴圈數次，然後延伸幾分鐘，再進行迴圈，有時候可以加大產物的量
4.酶濃度
過高容易導致非特異性產物的形成
5.離子濃度
過高容易導致非特異性產物的增加
6.dntp
濃度過高會抑制酶的活性，引起錯配
希望對你有所幫助^_^
15樓：南京金益柏生物科技****
有些pcr儀器不是很穩定，建議你做梯度或者後繼試驗的時候，盡量將pcr管放在儀器的中間部分，同時儀器的四個角落可以放裝滿水的pcr管，這樣可以使儀器溫度相對穩定些。
同時加樣的時候，盡量在冰上操作，引物和酶避免反覆凍融。
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