1樓：匿名使用者
我用的是bio-rad的iq5，設定溶解曲線的時候是在反應程式設定那裡多設定一步，並且在採光那裡再設定一下，就好了
2樓：匿名使用者
我用的是abi的7500，你跑完之後 新建乙個程式檔案，然後在assay裡面選擇dissociation 再跑一次就行了。
3樓：匿名使用者
你是哪的，可以打8008304008**問達安公司，他們各省都有技術人員。
怎麼理解螢光定量pcr的溶解曲線
4樓：匿名使用者
螢光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度公升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是螢光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再公升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
5樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為螢光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出螢光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出螢光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的螢光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
請問：實時螢光定量pcr怎樣設定才能有溶解曲線？
6樓：匿名使用者
有一種可能是，在試驗開始的設定階段，需要為整個實驗設計出熔解曲線的程式，這個您可能忘記了。
7樓：匿名使用者
在設定反應程式時，在最後加一步
如何設定溶解曲線？
8樓：向天致信
一，理解做「溶解曲線」的意義：
普通pcr的擴增產物通過電泳跑膠的方式來區分目的產物和非目的產物（引物二聚體、非特異性擴增產物）。
而且當從高濃度到低濃度做梯度實驗時，我們從電泳圖上往往可以看到3個結果：
1 全部目的產物
2 部分目的產物，部分非特異產物（比目的產物大或者小）
3 全部非特異產物
螢光染料是dna雙鏈小溝結合物，本身不具有選擇性，能和所有的dna雙鏈接合。
在螢光pcr染料法里，我們單單通過pcr螢光擴增曲線來「判斷」結果是否合適？
顯然，單從螢光擴增曲線來「判斷」結果是不合適的。
因為，非特異性擴增產物也能與染料結合，s型的螢光擴增曲線中有區域性or全部的螢光來自非特異擴增的「貢獻」。
鑑定並區分目的產物與非特異產物
顯然，需要通過溶解曲線。
雙鏈dna都有自己的tm值。可以通過tm值的不同，將不同的產物分開。
在螢光pcr中，大多擴增100bp左右的產物（最好不超過200bp），退火和延伸時間較短。非特異的產物基本上都比目的擴增片段小。
所以，在做溶解曲線分析時，目的片段的tm值較大，而非特異的tm值較小。
二 降溫速率
普通螢光pcr儀的降溫速度預設是：1℃/cycle，能做hrm的儀器，降溫速度可設定為<1℃/cycle。
一般來說，不做hrm，就設定1℃/cycle即可滿足需要。
三 溫度區間
理論上來說，能包含住產物tm值和非特異產物tm值即可。
所以，一般設定在50℃-95℃區間內均可。
四 螢光採集時間
若出於節省時間的考慮，用5s都可以有比較不錯的結果。
9樓：匿名使用者
博凌科為-為你解答：我們用的是系統預設的模式，95度一分鐘，55度半分鐘，95度半分鐘
誰能具體解釋一下螢光定量pcr中溶解曲線的意思以及作用
10樓：匿名使用者
溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線，顧名思義，其跟模板（或其濃度）沒有關係，擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線，類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰（一般sybr法的目的基因在80~90℃之間），我說的是一般情況，這個跟擴增片段長短有關係。出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體（一般為60~75℃之間）視引物長度而定，而基因組dna汙染的峰會在90℃以後。
出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因（也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長）所致；基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染，注意實驗操作等避免模板汙染。
詳細請見我的回答
11樓：表詠蒿樂蓉
用syber
green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。反應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度公升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。
曲線的橫座標是溫度，而縱座標是螢光訊號的變化！開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的，接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再公升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。
如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
求助，螢光定量pcr擴增曲線和溶解曲線
12樓：抹不掉呀
實時pcr產物的tm值大小一般會在80deg;上下，所以溶解曲線不必從40deg;開始，可以從65deg;開始進行溶解曲線繪製，另外在產物之前出現的小峰，同時也在陰性對照中出現了，應該是引物二聚體或者是非特異的擴增。
13樓：真莉莉畢田
通過你的描述目前還有很多資訊不實很了解：目的片段長度？pcr反應條件？
管家基因的溶解曲線怎麼樣？做的什麼實驗？是否將產物跑了電泳，條帶怎麼樣？
你可以將上述問題整理一下在一些專業性較強的生物論壇發帖子讓其他大神幫你分析一下。比如丁香園、生物秀等等。
出現怪異的溶解曲線大部分都是機器設定或者反應體系的問題，建議：
1、將擴增產物跑一下電泳，看一下目的條帶亮不亮2、一般定量pcr擴增後目的片段的峰在80~90℃之間，反應條件確認一下設定是否有問題
3、適當增加模板量或者減少引物濃度。
4、用的是哪個公司的酶？問一下這個公司的技術支援
螢光定量pcr熔解曲線
14樓：匿名使用者
溶解曲線是在正常的pcr反應基礎上加乙個溶解曲線的反應條件，其中當溫度由60℃公升至95℃時，pcr儀每隔一定的溫度檢測一次訊號。最後將收集的訊號繪製出溶解曲線，然後將溶解曲線一次微分就會得到我們平時看到的峰性圖。每一條線代表著某個孔裡的反應體系裡產物的單一情況，某一條線如果為單峰且在一定合理的溫度範圍內（一般為80~90℃）則認為正常，如果為雙峰則可能有非特異性擴增。
由此可以判斷產物是否為目的基因且是否單一。內參有內參的線，目的基因有目的基因的線，同一條線不會出現兩個基因的峰。你可以看一下溶解曲線的橫、縱座標。
15樓：烏冬蛋白
內參量多，迴圈數少吧，我也不熟
第一次做螢光定量pcr，內參基因能夠跑出來，而且溶解曲線也比較好，但是目的基因完全跑不出來
16樓：匿名使用者
問題有可能如下
bai：
1） 模板du製備有問題。你可以用普通
zhipcr擴增，然後dao電泳確定是不是專模板有問題？
2） 引物問屬題：引物設計的好與否，對realtime 結果至關重要！ 可以用普通pcr確定你的引物擴增效率如何？ 模板可以選取乙個陽性質粒當模板。
3） realtime 體系配置出問題：好好想一下，該加的東西都加了沒？模板、染料、taq酶、等。
並且各個試劑的量一定要確定沒問題！
4） 程式設定：儀器的程式設定，plate的編排、退火溫度、等等。
祝你好運！！！
17樓：匿名使用者
沒有學過，高中化學也很差，所以，不知道！！！
抱歉啊，幫不了你！！！
螢光定量pcr結果溶解曲線有雙峰，結果可用嗎
18樓：匿名使用者
根據曲線初步判斷，整個實驗設計還可以！你做相對定量嗎，將樣品結果與對照看看基因表達量分析就可以了！ 如果絕對定量，需要進一步實驗吧！
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